1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1意义
自古以来，蚯蚓就被认为是土壤中最有价值的生物。大量研究表明，蚯蚓对土壤肥力尤其是作物生长的促进作用主要是通过氮素矿化过程，即蚯蚓能够促进土壤氮素有效性和植物氮素吸收。然而，集约农业的发展伴随着化肥的大量施用，蚯蚓在高氮土壤环境下是否同样能够同样发挥对植物生长的促进作用？蚯蚓的促进作物生长的作用仍依赖于氮素矿化过程的加速还是更多的依赖于其他因素？这些问题的解决不仅有助于我们了解土壤动物在集约农业高氮土壤中的功能，而且基于蚯蚓作用机制的认识为进一步指导农业土壤管理措施提供基础信息。本研究通过化学氮肥添加与否，研究蚯蚓在不同氮素浓度下对植物生长的影响，鉴于近年来土壤微生物群系被认为是影响植物生长的重要因素，所以特别针对蚯蚓对土壤微生物数量和群落结构的影响进行深入研究。
1.2国内外研究概况
2. 研究的基本内容和问题
2.1研究目标
蚯蚓通过取食、消化、排泄和掘穴等活动在体内外形成众多反应圈，从而对土壤生态系统的物理和化学过程产生影响。而土壤微生物在陆地生态系统的生态系统服务中具有关键地位。蚯蚓对土壤微生物群落结构的影响还缺乏系统的研究。
2.2研究内容
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法
通过种植玉米条件下添加蚯蚓和氮素的实验，用分子生物学技术研究蚯蚓影响玉米生长的微生物机制。
3.2技术路线
首先，进行种植玉米条件下添加蚯蚓和氮素的实验；其次，通过实验后处理，测定数据；再次，通过实验数据，分析微生物群落组成、土壤基本养分状况、玉米养分含量和生物量；最后，得出蚯蚓对土壤微生物群落结构的影响。
3.3实验方案
实验名称:玉米-蚯蚓-氮素相互作用对土壤微生物群落结构的影响
实验材料：威廉腔环蚓、玉米秸秆、盆钵、尿素（分析纯）、土壤（潮土）
实验布置时间：2015.8.17
实验处理：2氮素（0N，240N）2蚯蚓（-E， E）2植物（对照，玉米）5重复，共8个处理，每个处理五个重复。
表2种植植物实验处理
0N(0kgNha-1) | 240N(240kgNha-1) | |||
CK | CO | CK | CO | |
不加蚯蚓 | N0E0 | N0E0 CO | N240E0 | N240E0 CO |
添加蚯蚓 | N0E1 | N0E1 CO | N240E1 | N240E1 CO |
CK代表对照，CO代表玉米，E代表蚯蚓，N代表氮素。
3.4样品采集及测定方法
1.土壤、植物（玉米）采集的方法①土壤样品:盆钵内倒出的土混匀采样，尽量做到随机采样，装入自封袋中，写好标签，待处理测定。②植物（玉米）样品：a.地上部：把植物样地上部割下，放入大网袋，写好标签，带回实验室待处理。b.地下部：把盆钵内容物整体倒出，把根挑出，放入信封，写好标签，带回实验室待处理。
2.DNA提取：用试剂盒（FastDNASPINKitforSoil）提取，按照试剂盒的要求提取。
3.PCR-TRFLP：采用通用引物扩增细菌16SrDNA。正向引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，反向引物为1492r(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，其中正向引物5′端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成并标记。
25μL的PCR反应体系组成如下：PremixTaq混合酶(TaKaRa)8.5μL，正向和反向引物各1μL，模板20ng，ddH2O12.5ul。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性35min，57℃复性35s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃维持10min。
采用通用引物扩增真菌18SrDNA。正向引物为its1f(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)，反向引物为its4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，其中正向引物5端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成并标记。
25μL的PCR反应体系组成如下：PremixTaq混合酶(TaKaRa)8.5μL，正向和反向引物各1μL，模板20ng，ddH2O12.5ul。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性35min，55℃复性35s，72℃延伸30s，30个循环，72℃维持10min。
PCR产物用CutsmartMSPⅠ消化，反应体系20ul，其MSPⅠ0.5μL，Cutsmart2μL，ddH2O7.5μL，PCR产物10μL；37℃下消化2h。酶切产物的T-RFLP分析由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
4.qPCR：采用实时荧光定量仪进行qPCR反应，反应体系为：ddH2O6.8μL，338f0.4μL，518r0.4μL，ROXⅠ0.4μL，SYB10μL，DNA模板20ng。反应程序为：第一步：95℃预变性10min；第二步：95℃变性15s，60℃复性1min，循环40次；第三步：95℃变性15s，60℃复性1min，95℃15s。
5.土壤和植物（玉米）理化指标测定：土壤可溶性有机碳DOC、铵态氮NH4 -N、硝态氮NO3--N、速效磷含量，植物（玉米）地上部地下部生物
量，植物（玉米）中全氮全磷含量。
4. 研究创新点
目前，蚯蚓对土壤微生物群落结构的影响还缺乏系统的研究。
本实验将为以后蚯蚓对植物和微生物的影响研究及蚯蚓与植物之间通过微生物的一个间接作用研究提供一个新的视角。
5. 研究计划与进展
2015年11月，确定毕业论文导师以及毕业论文课题；
2015年11月~12月，参与实验，测定实验数据；
2016年1月初，完成毕业论文课题申报；
课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
