猪链球菌2型ESP基因缺失株的构建及其致病性的分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪链球菌（streptococcus suis ,ss),是一种重要的人兽共患病病原。

目前已发现有33个血清型，其中猪链球菌2型 ( streptococcus suis type 2 , ss2），致病力最强[1],感染猪呈现脑膜炎、关节炎、败血症等临床表现,人感染后引发心内膜炎、脑膜炎、关节炎、肺炎、败血性休克甚至死亡[2-4]。

自上世纪九十年代以来，我国暴发了两次重大的ss2感染疫情,给公共卫生带来严重威胁，引起世界范围的关注。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：构建猪链球菌2型的ESP基因缺失菌株及其毒力的变化；研究内容：1.设计PCR扩增引物； 2.构建ESP基因缺失质粒pSET4sESP； 3.筛选基因缺失株SS2-1△ESP； 4.BALB/c小鼠模型来评价ESP基因缺失前后细菌毒力的变化。

拟解决的关键问题：确定ESP对SS2毒力的影响

3. 研究的方法与方案

研究方法：1.PCR扩增ESP基因的同源臂序列； 2.构建重组质粒pSET4sESP；3.筛选基因缺失菌株SS2-1△ESP；4.BALB/c小鼠模型评价缺失株的毒力；技术路线： 设计及合成引物PCR扩增同源臂基因序列构建重组缺失质粒 pSET4sESP 筛选基因缺失株SS2-1△ESPBALB/c小鼠模型确定SS2-1及缺失株的毒力实验方案：1.PCR扩增目的基因片段，纯化、酶切、连接pSET4s质粒、转化至感受态DH5α，挑取阳性克隆，测序鉴定重组缺失质粒；2.将缺失质粒电转化进SS2-1感受态细胞，筛选基因缺失株，组合PCR和基因测序进行鉴定；3.BALB/c小鼠腹腔注射各不同浓度的SS2亲本株和缺失株，比较小鼠的存活率差异；可行性分析：1.试验技术比较成熟，无技术难度；2.实习实验室具备试验所需仪器；3.工作时间有保证

4. 研究创新点

本研究利用同源重组技术用抗性基因代替目标基因从而达到敲除基因的目的。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展 第1-4周（2017.9.4-2017.10.1）设计并合成PCR引物，构建重组敲除质粒 第5-17周（2017.10.2-2017.12.29）筛选缺失株△ESP，进行BALB/c小鼠模型攻毒试验，致病力分析； 第18-19周（2017.12.29-2018.1.12）分析、整理实验数据，撰写论文