sRNA对沙门氏菌移动性能和耐药性能的影响开题报告

全文总字数：4947字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

沙门氏菌作为影响范围最广的生物致病因子之一，其每年引发的食品安全事件不计其数，这对人体健康与食品生产加工企业造成了极大的危害。在适宜的环境下，细菌在食品加工接触表面生长并形成具有一定空间结构的细菌聚集体，被称为生物菌膜^[1]。由沙门氏菌在食品加工接触表面形成的生物菌膜是食品受其污染的主要源头之一，并可引发大范围的交叉污染，导致多起食物中毒事件的发生。目前多起食源性致病菌食物中毒事件的溯源结果显示，食品加工接触表面形成的生物菌膜是食品污染的原始祸源。菌体表面特性对生物菌膜形成可产生重要影响，比如其移动能力会对菌体粘附和生物菌膜产生显著影。环境和菌体的诸多因素会对粘附菌体和生物菌膜产生重要影响，本研究的重要方向为菌体的移动性能对食品加工接触表面生物菌膜形成的影响。菌体表面特性对生物菌膜形成可产生重要影响，研究表明细菌表面的得失电子能力、疏水性、菌体的聚集性能和泳动能力均会对菌体粘附和生物菌膜产生显著影响^[2]。很多食源性致病菌都有菌毛、鞭毛和纤毛等丝状的结构体，这些结构体通过相互作用对菌体粘附于固体表面发挥着重要作用^[3]。由鞭毛等菌体表面结构介导的菌体移动性显著影响其粘附性能，移动性强的菌株粘附性强于无移动性的菌株^[4]。细菌在的不同环境具有多样化的运动方式^[5]，分为：液体环境中的游动(swimming)、固体表面上的群泳(swarming)、蹭行(twitching)、滑行(gliding)和滑动(sliding)等，其中swimming是一种单一菌体运动的行为，而swarming是一种群体菌体运动的行为。研究表明，鞭毛组分对于生物菌膜形成的初始附着阶段是必不可少的，尤其是完整鞭毛丝在生物菌膜形成所需的细胞-表面相互作用中发挥着重要作用^[6]。

总结国内外的研究现状，可发现其研究方法与技术主要集中在不同菌株分离株与菌株血清型以及各种应激条件对生物菌膜的形成、侵袭性能、微观结构及胞外分泌物的影响等方面。当前，随着细菌基因测序技术的不断发展，人们在原核生物中发现了一类新的调控因子——非编码小rna（non-codingsmall rna，srna），长度为50~500 nt^[7]，在基因组中被转录但不翻译编码功能蛋白质。研究表明，菌体的srna对细菌在恶劣环境下的生长^[8]以及在细菌生物菌膜的形成^[9]起着重要的调控作用。此外，srna与相关靶基因的作用可以调控革兰氏阴性菌与宿主相互作用的过程中外膜蛋白的表达^[10]，因此srna与细菌的粘附、生长、毒力侵袭、耐药性等特性均密切相关。

本研究在srna对沙门氏菌粘附性能的影响的基础上，重点继续探讨srna对肠炎沙门氏菌三种移动性能swimming、swarming及twitching的影响以及其生物菌膜的粘附规律与菌体表面移动特性之间的关系，并确定与沙门氏菌移动性能有关功能基因的表达规律，对寻求针对性控制沙门氏菌生物菌膜的技术策略具有重要意义为研究肉品加工中沙门氏菌交叉污染的风险评估提供参考。此外，对野生株及突变株在菌体的表面特性与耐药性能进行深入探讨，以在分子层面上全面揭示 srna对菌体表面特性与耐药性能的调控作用，完善特征性srna的调控网络；重点分析生物菌膜的粘附规律与菌体表面移动特性之间的关系，有助于从转录水平上阐明生物菌膜的形成机理，完善其科学理论体系，并在食品工业上为制定沙门氏菌的工业化控制措施提供理论参考。

2. 研究的基本内容和问题

本实验旨在相同的培养环境条件下，通过测定五种菌株扩散圈直径大小以及其形态表征，从而确定肠炎沙门氏菌四种srna缺失的突变株arc、inv、orm及oxy是否与野生型61在swimming、swarming及twitching等三种移动性能指标上存在着显著差异，从而推测移动性能与该四种功能基因的表达存在着何等程度的联系。此外，通过耐药性测试，可得出五株菌是否对待测抗生素产生多重耐药性，以及探究四种特征性sran的缺失是否会显著影响肠炎沙门氏菌的抗菌药物敏感性。

实验内容主要由菌株移动性能与耐药性能两部分组成。swimming实验取初始浓度od600nm一致的五株菌液3 μl接种于配制好的swimming平板中心处，在37℃下培养8h，并于2、4、5、6、7、8h共六个时间点下用游标卡尺测定菌株扩散圈直径大小以及用菌落计数仪拍照扩散圈形态。swarming实验取初始浓度od600nm一致的五株菌液3 μl接种于配制好的swarming平板中心处，在37℃下正置培养20h，并于10、14、20h共三个时间点下用游标卡尺测定菌株扩散圈直径大小以及用菌落计数仪拍照扩散圈形态。twitching实验用无菌牙签蘸取初始浓度od600nm一致的五株菌液接种于twitching平板中心处，在37℃下倒置培养24h后，用游标卡尺测定菌株扩散圈直径大小以及用菌落计数仪拍照扩散圈形态。抗菌药敏试验采用clsi m100文件中mueller-hinton琼脂纸片扩散法，使用六大类共11种不同的抗生素进行测试，抗生素包括：青霉素类（氨苄西林，10μg）、头孢类（头孢噻肟，30μg；头孢西丁，30μg；头孢曲松，30μg;头孢哌酮，75μg）、氨基糖苷类（阿米卡星，30μg；庆大霉素，10μg；链霉素，10μg）、四环素类（四环素，30μg），氟喹诺酮类（环丙沙星，5μg），苯丙醇类（氯霉素，30μg）。用用无菌生理盐水将第一次活化菌液的浓度分别调整至0.5麦氏单位，每株菌的菌液各取200μl均匀涂布在mueller-hinton琼脂表面。用无菌镊子将药敏纸片轻压在该琼脂上，使其紧贴琼脂表面，并于37℃培养24h，每组试验每株菌设置5个生物学重复。用游标卡尺从平板背面测量抑菌圈直径，以肉眼无法观察明显生长的区域作为抑菌圈边缘，根据clsi m100文件对结果解释为敏感、中间或抗性。参考krumperman的方法计算多重抗生素抗性（mar，multipleantibiotic resistance）指数，mar指数每种分离物的抗性抗生素数/测试的抗生素总数。在mar结果中被解释为“中间”的分离物则被认为mar指数“敏感”。

本实验拟解决的关键问题主要有测定61、arc、inv、orm及oxy五株菌在swimming、swarming和twitching三种平板下的菌株扩散圈的直径大小，对突变菌株与野生型菌株的移动性能进行比较和分析；探究四种特征性sran的缺失是否会显著影响肠炎沙门氏菌的抗菌药物敏感性。

3. 研究的方法与方案

研究方法主要利用微生物操作对微生物进行平板接种与培养。

技术路线如下：

4. 研究创新点

（1）目前国内多数研究中的菌株并非来源于食品或者食品加工接触面，菌株差异性导致研究结果对实际指导意义有限。本实验选用肉源性沙门氏菌，更符合于实际的食品生产加工。（2）缺乏针对沙门氏菌生物菌膜的移动能力的定量研究，其是研究交叉污染中定量风险评估的基础。（3）sRNA作为细菌中新发现的一类重要的调控因子，对沙门氏菌的生长、侵袭以及生物菌膜的形成具有重要的调控作用，而关于sRNA对菌体表面移动特性调控的研究目前少有报道，尤其是对twitching的研究在国内几乎为空白。（4）关于sRNA对细菌抗生素敏感性的影响及调控的研究较少。

5. 研究计划与进展

2018年11-12月：通过预实验确定最佳的实验参数，发现实验操作问题，以及找出实验失败的原因

2018年12月-2019年3月：进行swimming、swarming及twitching的正式试验

2019年4月：进行抗生素耐药性的预试验与正式试验