双蛋白发酵酸奶的开发及理化特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1研究意义

蛋白质是乳品首先需要考虑的指标。在我国，凭借动物蛋白资源很难满足消费乳品的需求，并且食用过多的动物蛋白也会给健康带来不利影响，因此，可以考虑用植物蛋白代替部分牛奶，选择合适的生产工艺，生产成本较低廉、质量保证的双蛋白奶[1]。双蛋白酸奶与普通酸牛奶不同之处是除使用新鲜牛奶(或奶粉)、白砂糖为原料外,还以大豆蛋白作为主要原料,经乳酸菌发酵而成为活性乳酸菌双蛋白酸牛乳。大豆蛋白和牛奶蛋白结合在一起发酵,利用微生物的发酵作用既能发挥大豆的营养功效,又能破坏大豆中的抗营养因子,使大豆蛋白质的消化率得到明显提高,不仅增加并优化奶制品中的蛋白质,也增加奶制品中维生素和矿物质等含量,营养互补,相得益彰[2]。

2国内外研究概况

2. 研究的基本内容和问题

1研究目标

开发一种双蛋白发酵酸奶，并对其理化特性进行研究。在实验中首先确定使豆浆与所选择牛乳的蛋白质相近的豆水比，然后选择六个合适的豆乳与牛乳比，选择合适的菌种对六种不同比例的混合样品进行发酵，对发酵产品进行多个指标测定包括营养特性如蛋白质和理化特性如流变、粘度、电镜观察等，比较6组实验结果，最后选择出营养丰富，感官性状良好的最佳比例。

2研究内容

3. 研究的方法与方案

1研究方法

1：游离巯基含量的测定：称取冷冻干燥的醇溶蛋白样品（40mg），加入4mLTris-Gly-EDTA（1L缓冲液中含2.5%SDS，10.4Tris，6.9g甘氨酸和1.2gEDTA，pH8.0）缓冲液，将样品与缓冲液用涡旋振荡器混匀，每十分钟涡旋一次。重复三次后加入40μLDTNB（40mg/mL）溶液，迅速混合后在25℃避光反应30分钟后离心。在421nm处测量上清液的吸光值。使用还原型谷胱甘肽的校准曲线将吸光度值转换为游离SH的量。

2：傅里叶红外光谱：精确称取1mg发酵液冻干样品，与100mg溴化钾充分混合后研磨压片测定FTIR图谱，扫描次数64次，分辨率4cm－1，扫描范围为400cm－1~4000cm－1。使用Omnic和peakfit软件分析蛋白二级结构的变化，对酰胺I带（1600~1700cm－1）进行基线校正，高斯平滑和去卷积后分析，得到各二级结构的分布图，根据各二级结构对应峰面积所占峰面积的比例定量结算出各二级结构的含量。

3：表面疏水力：根据Kato等采用的ANS荧光探测针对蛋白质疏水性进行测定。取终止反应后的发酵液，20℃，5000r/min离心15分子，收集清液用Bradford法测定蛋白浓度，并用依次稀释（浓度在1mg/mL，0.8mg/mL，0.6mg/mL,0.4mg/mL,0.2mg/mL）后，取不同浓度样品的溶液1mL，分别加入5μL浓度为8mmol/L的ANS溶液。室温下，经震荡后避光静置20min，再测定样品的荧光强度。实验中激发波长λex=370nm，发射波长λex=490nm，夹缝为5nm。以荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段斜率即为蛋白质分子的表面疏水性。

4：蛋白质分子非共价作用力的测定：以磷酸缓冲液（0.05M，pH7.0）为木母液，配置如下缓冲液溶解醇溶蛋白：0.05MNaCl（S1），0.6MNaCl（S2）0.6MNaCl 1.5M尿素（S3），0.6MNaCl 8M尿素（S4）。取下50mg冷冻干燥的醇溶蛋白样品，分别溶解于10ml上述缓冲液中，置于25℃下萃取1小时，10000g离心20分钟。使用凯氏定氮法测定上清液中的蛋白质浓度。其中离子键的贡献表示为S2和S1中醇溶高蛋白的溶解度之差，疏水作用的贡献表示为S4和S3中的醇溶蛋白的溶解度之差。

5：肽含量测定：根据邻苯二甲醛（OPA）测定法测量每个消化阶段结束时的肽含量。OPA溶液使用由Rui等人报道的先前方法制备。（2016b）28。（用150mL双蒸水彻底溶解200mgSDS和7.62g四硼酸钠，用4mL乙醇溶解160mgOPA，二者混合并加入176mgDTT和400μLβ-巯基乙醇，定容至200mL即为OPA反应试剂(避光保存，现配现用)）。将2mL蛋白溶液转移至截留分子量为10kDa的Millipore超滤管中，在4℃、3000r/min条件下离心30min，收集蛋白渗透液，冻存于-18℃待测。吸取50μL样液与2mLOPA反应试剂混匀，室温下精确反应2min，测定340nm处吸光度值。多肽含量用胰酪蛋白胨当量表示(CTE)，以蒸馏水代替样品反应，作为空白对照。测试进行三个平行。

6：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)：准确称取40mg燕麦冻干粉，加入1mL0.1MTris-HCLpH8.8缓冲液，颠倒混匀1h，在4℃、12000r/min条件下离心20min，收集蛋白上清液，冻存于-18℃待测。将提取液与2上样缓冲液1:1(v:v)混合，在沸水浴中保温3-5min，取出待用。跑电泳时，浓缩胶和分离胶浓度分别为4%和15%，上样量为20μL，先调节电压为60V，当样品进入分离胶后再调节电压为120V，溴酚蓝移至底部不足0.5cm时切断电源，停止电泳。

7：流变测量：豆浆凝乳的凝胶化过程是基于Harbourne，雅基耶，＆奥赖尔登的方法观察到的（2011）0.23将接种SMTP立即加载的PhysicaMCR301流变仪的平行板（直径为50mm）（安东帕，奥地利之间），并且两个板之间的间隙设定为1.0mm。修剪掉过量的样品，并使用硅油覆盖样品的边缘以避免测量期间的蒸发。在凝胶化期间以0.1Hz的频率和1％的应变连续记录储存（G'）和损失（G）模量。每2分钟测量6小时。胶凝时间定义为凝胶G'≥1Pa时的点。所有测量均在线性粘弹区内37℃下进行。将pH上记录使用EasyFerm加PHI弧120米（汉密尔顿博纳杜茨AG）连接到使用汉密尔顿设备管理器软件，它允许在整个发酵过程中的pH水平的连续测量和记录一个计算机线。

8：总酸含量的测定：采用滴定法，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定。总酸含量定义为1g样品所含酸的百分含量，以乳酸计。总酸含量的测定采用滴定法测定。准确称取2g样品，在研钵中捣碎，加入15mL无二氧化碳蒸馏水，75℃水浴加热0.5h，过滤取滤液，定容至250mL。准确吸取50mL滤液，滴入3-4滴酚酞指示剂，用标定后的0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，至溶液呈微红且30s不褪色，记录所消耗氢氧化钠的体积。总酸定义为1g发酵后的燕麦中所含酸的百分比，酸度以乳酸计。X(%)=(VcK)100/(m50/250)式中，X为样品总酸的质量浓度(%)；c为氢氧化钠浓度(mol/L)；V为滴定消耗氢氧化钠体积(mL)；m为样品质量(g)；K为换算系数，即1mmol氢氧化钠相当于主要酸的克数(以乳酸计，折算系数为0.09)。

9：乳酸菌活菌计数：采用平板计数法测定。量取0.4mL发酵样品，加入225mL0.85%(v/v)无菌生理盐水，混匀后进行十倍系列稀释，选取3个连续且适宜的浓度梯度（106、107、108），各吸取1mL菌液于培养皿中，倾注法加入适量的MRS琼脂培养基，凝固后倒置于37℃培养箱，培养48h。

10：考马斯亮蓝G-520法测蛋白质含量：

（1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100mL，制成100μg/mL的原液。

（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

（3）标准曲线制作：

（4）样品中蛋白质含量测定：准确加入0.1mL样品，再加入0.9mL蒸馏水，5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在紫外分光光度计595nm波长下比色，记录吸光度。

（5）结果处理：根据吸光度，在标准曲线上查的相应的蛋白质含量（μg）。

9：pH的测定：直接用pH计进行测定。

10：凯氏定氮法测量蛋白质含量：

仪器:K1100凯氏定氮仪、SH220石墨消解仪(可同时消解20个)、分析天平、消化管(与消解仪、定氮仪配套)、烘箱；

主要试剂：浓硫酸(18.4g/ml，AR);硫酸铜，AR;硫酸钾，AR;硼酸(20g/L，按混合指示剂：硼酸=1:100加入指示剂);40%氢氧化钠溶液;混合指示剂(1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合);蒸馏水;硫酸标准溶液[C(1/2H2SO4)=0.1037mol/L].

方法:消化采用减量法准确称取1g(精确至0.0001g)酸奶样品(注意不要挂壁)，加入0.2g硫酸铜，3.0g硫酸钾，再加入8.5ml浓硫酸，摇匀(3种酸奶各做6个平行)。将消化管置于HanonSH220石墨消解炉上，先设定200℃，加热30min，再设定300℃，加热30min再将温度调制380℃，加热30min，此时消解液变绿，再调至420℃消解30min，冷却，待蒸馏(同时做两个空白试验)。

蛋白质含量的测定:将冷却后的消化管置于HanonK1100全自动凯氏定氮仪上进行测定。先检查定氮仪，确认冷凝水已经打开，按照仪器提示设定好参数，稀释水10ml、硼酸20ml、加碱40ml、蒸馏5min，蒸馏完成后仪器进行自动滴定并计算打印样品的含氮量以及蛋白质含量。

2技术路线

3可行性分析

（1）立论可行

双蛋白酸奶生产技术技术作为一种相对成熟的食品加工技术，已有研究证明其优于酸牛奶营养价值又遮盖了酸豆乳的不适味道，但对其在发酵过程中生化特性的改变仍需要进一步试验探究。

而我院的生物工程实验室也曾进行过类似实验，该项目是原有研究基础的延续，故本项目立论可行。

（2）实验方案可行

实验方案参照相应方法生产双蛋白酸奶，而对其进行的不论是理化测试还是营养指标测定，每项检测都参考相关文献施行。本实验所采取的研究手段有相对成熟可靠的方法，并且大多数指标都已在我院的生物工程实践中得到应用或已通过预实验验证了其有效性，故本项目实验方案可行

4. 研究创新点

特色或创新之处

大豆蛋白和牛奶蛋白结合在一起发酵,利用微生物的发酵作用既能发挥大豆的营养功效,又能破坏大豆中的抗营养因子,使大豆蛋白质的消化率得到明显提高,不仅增加并优化奶制品中的蛋白质,也增加奶制品中维生素和矿物质等含量,营养互补,相得益彰。生产双蛋白酸奶不仅可以降低生产成本，提高产品的营养价值，还可以缓解我国牛奶资源紧张的局面。双蛋白酸奶将成为未来乳品工业市场开发的新的热点。

过去的研究专注于三个方面，

一个是探索发酵条件的改进：

5. 研究计划与进展

项目计划及预期进展

（1）：2017年12月：确定豆水比，熟练掌握样品制备

（2）：2018年1月微生物指标测定